圖3游離AB原藥(A)和AB MSN納米藥物(B、C)的酸反應H2釋放行為。

在四種不同的磷酸鹽緩沖溶液(pH=5.0、5.8、6.8、7.4)中測試了AB釋放H2的酸反應分解行為。從圖3A可以看出，游離AB在酸性磷酸鹽緩沖溶液中很快分解成H2，而且磷酸鹽緩沖溶液的酸度越高，H2釋放越快。即使在pH=6.8的微酸性環(huán)境(模擬瘤內(nèi)酸性微環(huán)境)中，H2的釋放速率也高達19.8μM/h，反映了高酸反應性。然而，在pH=7.4的PBS(模擬正常組織環(huán)境)中，游離AB沒有發(fā)生明顯的分解。AB MSN納米藥物也具有類似的AB分解和H2釋放的酸反應性(圖3B)，這使得該納米藥物能夠實現(xiàn)瘤內(nèi)酸性微環(huán)境響應性H2釋放，從而實現(xiàn)高效氫治療。此外，值得注意的是，與游離AB相比，MSN中AB的分解/釋放速率大大降低。PBS酸度越低，H2釋放率的降低幅度越大(圖3A和C)。這應該是由于上文提到的MSN與AB之間的氫鍵吸引力起到了穩(wěn)定作用。這種分解行為的減輕為持續(xù)釋放H2(>2天)帶來了好處，非常有利于長期氫氣治療。

圖4用MB+Pt探針測定三種不同濃度(25、50和100g/mL)的AB MSN納米藥物的細胞內(nèi)吸收(A)。

使用亞甲基藍(MB)加膠體鉑納米粒子(Pt)的典型氫探針進一步研究了AB MSN納米藥物的細胞內(nèi)H2釋放情況。首先，圖4A中用紅色熒光RITC(羅丹明B異硫氰酸酯)染料標記MSN的共聚焦觀察結果證實，AB MSN納米藥物在很大程度上可被癌細胞吸收。定性結果如圖4C所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞的藍色逐漸變淡，這表明在鉑的催化作用下，釋放的H2還原了MB，從而增加了細胞中H2的釋放量。使用微孔板閱讀器記錄664納米波長處甲基溴特征吸收峰的吸光度，然后根據(jù)繪制的標準曲線轉換成H2濃度，進一步收集定量數(shù)據(jù)(圖S3)。如圖4B所示，AB MSN納米藥物在細胞內(nèi)逐漸釋放出H2，細胞內(nèi)H2釋放率取決于AB MSN納米藥物的濃度。納米藥物濃度越高，細胞內(nèi)的H2釋放越快。AB MSN納米藥物在細胞內(nèi)釋放H2的現(xiàn)象得到了證實，這為進一步實施氫療法提供了可能。

圖4氫氣釋放(B-D)：定量數(shù)據(jù)(B)，以及100g/mL納米藥物細胞內(nèi)氫氣釋放時藍色減少的定性觀察(C)。用基于DCFH-DA探針的ROS檢測試劑盒檢測AB MSN納米藥物誘導的HeLa細胞內(nèi)ROS減少情況(D)。

酸反應性氫氣釋放行為表明，所構建的AB MSN納米藥物尤其適用于癌癥治療，因為瘤內(nèi)微環(huán)境通常呈微酸性(pH=6.2-6.8)。Ohta等人發(fā)現(xiàn)，施用氫氣可選擇性地減少細胞毒性活性氧(ROS)，如羥自由基，而羥自由基通常在腫瘤細胞中過度表達。氫氣治療癌癥的一個公認機制是細胞內(nèi)氫氣的抗氧化能力。因此，我們研究了AB MSN納米藥物對細胞內(nèi)ROS水平的影響，以檢測其抗癌潛力。我們使用基于DCFH-DA探針的ROS檢測試劑盒來檢測納米藥物治療前后HeLa細胞內(nèi)的ROS水平。從圖4D中可以發(fā)現(xiàn)，AB MSN納米藥物的使用使HeLa細胞中的細胞內(nèi)ROS水平顯著下降，并且隨著納米藥物濃度的增加，細胞內(nèi)ROS水平的下降幅度越來越大。這應歸功于納米藥物在細胞內(nèi)釋放的H2(圖4)。這些關于酸反應性H2釋放和細胞內(nèi)ROS降低的積極結果使氫治療癌癥成為可能。

圖5游離原藥AB、載體MSN、分解產(chǎn)物B(OH)2ONH4和AB MSN納米藥物對HeLa(A)、B16-F10(B)和U87癌細胞(C)以及Hek-293T正常細胞(D)的細胞毒性比較。

使用三種典型的癌癥細胞系(HeLa、B16-F10和U87細胞)和一種正常細胞系(Hek-293T細胞)進一步研究了AB MSN納米藥物的體外癌癥治療效果。從圖5A-D可以看出，在較寬的濃度范圍(0-100g/mL)內(nèi)，載體MSN和藥物分解產(chǎn)物B(OH)2ONH4對所研究的任何細胞都沒有明顯的細胞毒性，而游離AB原藥在相對較高的藥物濃度(≥50g/mL)下表現(xiàn)出普遍的細胞毒性，這可能是由于如上所述游離AB在細胞內(nèi)過快釋放H2所致(圖3A)。相比之下，相同濃度的AB MSN納米藥物對三種癌細胞的細胞毒性都明顯增強(圖5A-C)，但對正常細胞的細胞毒性卻有所降低(圖5D)。納米藥物的這種選擇性抗癌特性應源于高效的細胞內(nèi)藥物遞送和H2的長期持續(xù)釋放(圖3B)。納米藥物的細胞內(nèi)藥物保護遞送避免了AB分解出細胞，從而增加了細胞內(nèi)的H2含量，提高了氫氣治療的療效。同時，納米藥物的H2持續(xù)釋放消除了過快釋放對正常細胞的負面影響。此外，外源H2還能發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原水平的作用，包括減少癌細胞中高表達的ROS(圖4)，從而殺死癌細胞。AB MSN納米藥物具有選擇性抗癌特性，這一令人興奮的發(fā)現(xiàn)鼓勵我們開展體內(nèi)癌癥治療實驗。

圖6使用AB MSN納米藥物對4T1腫瘤小鼠進行治療的結果：注射PBS對照組、游離原藥AB、載體MSN、分解產(chǎn)物B(OH)2ONH4和相同摩爾濃度的AB MSN納米藥物(AB稀釋10倍除外)后腫瘤體積的變化(A)，治療20天后腫瘤重量的比較(B)，小鼠體重隨時間的變化(C)，以及小鼠生存能力隨時間的變化(D)。

此外，研究人員還利用攜帶HeLa腫瘤的Balb/c裸鼠模型研究了AB MSN納米藥物的體內(nèi)癌癥治療效果。小鼠被隨機分為五組，即空白對照組(PBS)、三個對照組(MSN、AB、B(OH)2ONH4)和一個治療組(AB MSN)。從圖6A和S4可以看出，注射與AB MSN納米藥物相同摩爾濃度的MSN和B(OH)2ONH4(16.5毫克/毫升，PBS，100升)基本上不能明顯抑制腫瘤生長，而相同摩爾濃度的游離AB會導致注射小鼠急性死亡，這與體外實驗結果一致。因此，將AB稀釋10倍作為AB對照組。盡管AB組顯示出抑制腫瘤的效果，但游離AB也會導致小鼠持續(xù)死亡(注射后8天完全死亡)，其毒性太強，與體外情況類似(圖6D)。相比之下，未稀釋的AB MSN組在注射后20天內(nèi)未造成小鼠死亡(圖6D)，這說明基于MSN的納米藥物制劑的保護作用降低了毒性。此外，在20天的治療過程中，AB MSN組能很好地抑制腫瘤的生長(圖6A和S4)。注射20天后，提取治療小鼠的所有腫瘤進行對比，進一步證實了AB MSN納米藥物的顯著治療效果(圖6B)。在整個治療過程中，不同治療組小鼠的體重幾乎沒有變化(圖6C)。此外，所有小鼠在治療20天后均被人道處死，取其主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)進行H&E染色組織病理學評價，發(fā)現(xiàn)所有治療組均未對主要臟器造成明顯損傷(圖7)，反映了AB MSN無明顯的系統(tǒng)毒性。簡而言之，AB MSN納米藥物在體內(nèi)表現(xiàn)出了與體外實驗一致的高效、低毒的腫瘤治療效果。

圖7用PBS對照組、載體MSN、游離原藥AB、分解產(chǎn)物B(OH)2ONH4，以及相同濃度的AB MSN納米藥物(AB稀釋10倍除外)治療20天后，主要器官(心、肝、脾、肺和腎)的HE染色結果。