討論

我們的數(shù)據(jù)明確顯示，反硝化作用是與人類(lèi)相關(guān)的微生物群落中的一個(gè)相關(guān)過(guò)程。迄今為止，人們一直認(rèn)為人類(lèi)體內(nèi)的NO完全還原過(guò)程僅限于硝酸鹽還原成氨(DNRA)的異纖化過(guò)程，因?yàn)閺娜祟?lèi)體內(nèi)分離出的大多數(shù)細(xì)菌都能進(jìn)行這一反應(yīng)。眾所周知，DNRA是一種嚴(yán)格的厭氧過(guò)程，在厭氧還原環(huán)境中比反硝化作用更受歡迎。因此，在人體腸道的還原性厭氧環(huán)境中，二硝化還原反應(yīng)可能占主導(dǎo)地位，而在氧化程度較高的牙菌斑中則存在反硝化作用。反過(guò)來(lái)，可以想象DNRA存在于不易被清除的牙菌斑中，因此，牙菌斑一直處于缺氧狀態(tài)，而且還原程度較高。從理論上講，在這種生物膜中，NO2-的還原可能與氨的厭氧氧化(anammox)結(jié)合在一起(圖5，黑色虛線)，特別是如果宿主組織或二硝基氧化還原酶的蛋白質(zhì)降解可以提供氨的來(lái)源，正如在海洋開(kāi)放水域棲息地所報(bào)道的那樣。不過(guò)，在細(xì)菌和NO3-共存的其他氧化環(huán)境中，也可能存在反硝化作用。例如，除唾液外，NO3-還存在于其他體液中，這些體液可能提供了一個(gè)相當(dāng)氧化的環(huán)境(例如，血液中的NO3-為20-40μM，尿液中的NO3-約為500μM)。因此，反硝化作用可能與其他疾病或健康部位的微生物生物膜有關(guān)，如囊性纖維化肺、中耳炎耳朵、植入物、導(dǎo)管和陰道粘膜等。

圖5、人類(lèi)牙菌斑中唾液NO3-的微生物轉(zhuǎn)化及其可能的后果?；疑€條表示以前報(bào)道過(guò)的途徑。虛線表示本研究或其他研究中尚未報(bào)道的牙菌斑中可能存在的途徑。彩色線條表示本研究認(rèn)為可能存在的途徑。綠線表示生物介導(dǎo)的途徑，紅線表示化學(xué)或物理介導(dǎo)的途徑。如果通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在牙科生物膜中檢測(cè)到了介導(dǎo)反硝化各個(gè)步驟的酶的編碼基因，則將其描繪出來(lái)。未檢測(cè)到依賴(lài)細(xì)胞色素c的NO還原酶(cNorB)的基因。Anammox=氨的厭氧氧化；DNRA=將硝酸鹽還原為氨。

反硝化和DNRA在最終產(chǎn)物、代謝控制和釋放的中間產(chǎn)物方面存在本質(zhì)區(qū)別，因此對(duì)宿主的生理機(jī)能產(chǎn)生不同的影響。銨是DNRA的最終產(chǎn)物，宿主細(xì)胞和相關(guān)微生物可將其作為一種固定氮形式利用。此外，人體內(nèi)的DNRA可能會(huì)使銨積累到有害濃度。相比之下，反硝化作用的最終產(chǎn)物N2是宿主固定氮的損失，不會(huì)影響人體細(xì)胞。此外，微生物反硝化作用產(chǎn)生的信號(hào)分子NO可能會(huì)影響宿主細(xì)胞與其相關(guān)微生物群落之間的相互作用。

有趣的是，牙齒生物膜中的反硝化作用是在有氧條件下發(fā)生的。這表明牙菌斑并不一定要在缺氧的微環(huán)境中才能發(fā)生反硝化作用。分離的細(xì)菌菌株和微生物群落偶爾也能在有氧氣的情況下進(jìn)行反硝化。在富含NO3-的生境中，有氧反硝化可確保穩(wěn)定的電子接受過(guò)程，該過(guò)程暴露于O2濃度的頻繁波動(dòng)中，無(wú)需新酶系統(tǒng)的能量需求表達(dá)。這可能完全適用于口腔棲息地，因?yàn)榭谇恢型僖篘O3-濃度高，O2濃度也可能波動(dòng)。

盡管牙科生物膜中的微生物種類(lèi)繁多，但我們只能檢測(cè)到依賴(lài)喹啉型(qnorB)的呼吸型NO還原酶基因，而不能檢測(cè)到依賴(lài)細(xì)胞色素c型(cnorB)的呼吸型NO還原酶基因。有趣的是，在非反硝化病原菌中也發(fā)現(xiàn)了編碼qNorB的基因，在這些病原菌中，qNorB參與NO解毒，而不是呼吸電子傳遞。顯然，在調(diào)查的牙科生物膜中，呼吸性NO還原完全由qNorB介導(dǎo)。此外，qNorB還可以作為一種保護(hù)酶，抵御來(lái)自宿主細(xì)胞、NO2-酸性分解物和其他生物膜細(xì)菌的有毒NO。

我們的研究結(jié)果為牙菌斑中的氮轉(zhuǎn)化建立了一個(gè)機(jī)理模型(圖5)。首先，唾液中的NO3-還原形成NO2-，然后進(jìn)一步反硝化形成中間產(chǎn)物NO和N2O，最后形成N2(圖5，綠線)。除了生物轉(zhuǎn)化步驟外，該機(jī)理模型還包括一個(gè)由pH值控制的從NO2-到NO的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟(圖5，紅線)。如果酸性發(fā)酵使牙菌斑的pH值小于5，就會(huì)發(fā)生從NO2-到NO的化學(xué)轉(zhuǎn)化。在酸性條件下，NO的高周轉(zhuǎn)率會(huì)導(dǎo)致牙科生物膜對(duì)氧氣的吸收減少。這表明牙菌斑中不同微生物活動(dòng)的代謝耦合是由NO介導(dǎo)的。此外，細(xì)菌對(duì)作為信號(hào)分子的NO也有反應(yīng)。具體來(lái)說(shuō)，NO參與了細(xì)菌從生物膜中的擴(kuò)散。綜上所述，NO可能是平衡天然牙菌斑群落發(fā)展的細(xì)菌衍生因子。因此，從"生態(tài)牙菌斑假說(shuō)"的角度來(lái)看，NO可能是一個(gè)重要的因素。"生態(tài)牙菌斑假說(shuō)"認(rèn)為，口腔中的環(huán)境因素(例如pH值和唾液中的NO3-)決定了牙菌斑微生物群落是以維持健康的微生物為主，還是以致病微生物為主。

人體細(xì)胞可通過(guò)NO合酶活性從精氨酸中產(chǎn)生NO，并對(duì)其他細(xì)胞產(chǎn)生的NO信號(hào)分子做出反應(yīng)。在牙齦組織中，NO參與血壓調(diào)節(jié)和炎癥過(guò)程，如牙周疾病。在酸性條件下，牙菌斑中的深度平均NO濃度從0.08μM增加到0.15μM(圖2g)，處于生理有效范圍內(nèi)，可用于調(diào)節(jié)局部血壓、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件以及調(diào)節(jié)牙菌斑附近組織的免疫系統(tǒng)。因此，我們假設(shè)pH值波動(dòng)和牙菌斑脫氮可通過(guò)調(diào)節(jié)NO的濃度(圖5，綠線)對(duì)牙齦局部的血流、神經(jīng)之間的信號(hào)傳遞和炎癥過(guò)程產(chǎn)生影響。NO介導(dǎo)的相互作用在致齲斑塊與牙周斑塊中有所不同，因?yàn)閮烧叩膒H值不同。致齲菌斑中的低pH值可能會(huì)誘導(dǎo)化學(xué)NO的形成，從而導(dǎo)致高濃度的NO，而牙周菌斑中NO的形成僅限于微生物過(guò)程，因?yàn)槠鋚H值大于7。如上所述，微生物反硝化作用可能與人體其他健康和患病部位有關(guān)。因此，從更廣泛的意義上講，微生物反硝化作用可被視為人體形成NO的另一種途徑，并為人體相關(guān)微生物與鄰近宿主細(xì)胞之間的共生互動(dòng)提供了基礎(chǔ)。

牙菌斑的存在導(dǎo)致口腔空氣中作為反硝化中間產(chǎn)物的N2O的積累，這取決于唾液中NO3-的濃度。這表明反硝化作用是在體內(nèi)進(jìn)行的，而飲食中NO3-的攝入會(huì)影響牙菌斑的反硝化作用。15名未刷牙且唾液中NO3-/NO2-濃度未受操控的志愿者的口腔N2O排放平均速率為80nmol/h。雖然早先對(duì)人類(lèi)呼吸空氣進(jìn)行的調(diào)查顯示N2O濃度高于環(huán)境大氣水平，但我們的研究首次提出了這種溫室氣體的口腔相關(guān)排放率。根據(jù)我們的數(shù)據(jù)推斷，以目前全球67億人口計(jì)算，人類(lèi)口腔相關(guān)的N2O排放量為0.00013TgN/a，占每年向大氣排放的N2O總量16.4TgN/a的0.0008%，微不足道。

牙齒生物膜是人類(lèi)口腔中產(chǎn)生N2O的主要場(chǎng)所。這一結(jié)果和微傳感器數(shù)據(jù)有力地表明，牙菌斑也是口腔中形成其他反硝化中間產(chǎn)物NO2-和NO的主要場(chǎng)所。因此，唾液中NO2-的測(cè)量結(jié)果并不能充分代表口腔中人類(lèi)宿主細(xì)胞形成NO的情況(圖5)。此外，在使用呼氣和唾液中的NO和NO2-測(cè)量值診斷全身性疾病(如腎衰竭和囊性纖維化)時(shí)，需要考慮牙菌斑的反硝化作用。一般來(lái)說(shuō)，與其他口腔表面相比，牙菌斑對(duì)反硝化中間產(chǎn)物的形成非常重要，這表明牙菌斑細(xì)菌與口腔表面的其他細(xì)菌一樣對(duì)口腔氮轉(zhuǎn)化非常重要。因此，牙齒生物膜和唾液中的NO3-濃度在調(diào)節(jié)體內(nèi)NO2-濃度中起著至關(guān)重要的作用，并影響人體中與NO2-相關(guān)的生理功能，如缺氧性血管舒張和酸性胃中的抗菌活性(圖5，灰線)。

許多解剖部位，包括皮膚、口腔、胃、結(jié)腸和陰道，都居住著不同的微生物群落，這些群落具有多樣性的特點(diǎn)。這表明，由微生物介導(dǎo)的不同代謝途徑具有影響人體生理的多功能潛力。然而，與人類(lèi)相關(guān)的復(fù)雜微生物群落的活動(dòng)或功能潛力卻很少得到研究。因此，我們預(yù)計(jì)，如果將與人類(lèi)相關(guān)的微生物群落的研究擴(kuò)展到碳、硫、鐵等元素的循環(huán)，利用測(cè)量微生物群落原位活動(dòng)的技術(shù)，將能發(fā)現(xiàn)微生物與人類(lèi)之間意想不到的功能和相互作用?？捎糜谶@些實(shí)驗(yàn)的微生物生態(tài)學(xué)工具箱包括各種技術(shù)，如微電極、同位素或放射性標(biāo)記，可在大量培養(yǎng)基和單細(xì)胞水平上進(jìn)行檢測(cè)，所有這些技術(shù)都可與系統(tǒng)發(fā)育鑒定相結(jié)合。這種生態(tài)生理學(xué)方法可以直接檢驗(yàn)在人類(lèi)微生物組項(xiàng)目背景下產(chǎn)生的元基因組數(shù)據(jù)中提出的假設(shè)。

總結(jié)

人類(lèi)牙菌斑在唾液NO3-的基礎(chǔ)上介導(dǎo)反硝化作用。牙菌斑的反硝化作用是在有氧條件下進(jìn)行的，并以pH值依賴(lài)的方式導(dǎo)致生物和化學(xué)NO和N2O的形成。牙菌斑對(duì)O2的吸收受到NO的抑制。因此，NO的形成介導(dǎo)了菌斑細(xì)菌之間的新陳代謝相互作用。此外，NO產(chǎn)生的濃度水平允許向人類(lèi)宿主細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，這表明它在牙齦組織炎癥性疾病(即牙周病)的調(diào)節(jié)中起著重要作用。除了NO合成酶活性和二氧化氮的酸性分解外，微生物反硝化作用也是人類(lèi)形成NO的另一種途徑。牙菌斑中的反硝化作用是人類(lèi)口腔氮循環(huán)中間產(chǎn)物產(chǎn)生的相關(guān)場(chǎng)所，并且依賴(lài)于唾液中的NO3-。因此，用于檢測(cè)全身性疾病的呼氣分析應(yīng)考慮牙菌斑的活性，牙菌斑中的反硝化作用可能會(huì)影響整個(gè)人體的生理機(jī)能。