研究簡介：吸引殺滅（AK）珠子是生物、微生物殺蟲劑，作為合成土壤殺蟲劑的替代品而開發(fā)。對于線蟲控制，珠子基于藻酸鈣/淀粉共封裝產生二氧化碳（CO 2）的酵母釀酒酵母H205作為吸引成分，昆蟲病原真菌Metarhizium brunneum CB15-III作為殺滅成分。然而，共培養(yǎng)過程中珠子內部的物理化學過程仍不清楚。本研究論文主要研究了共包封的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和綠僵菌（Metarhizium brunneum）在基于海藻酸鈣的吸引和殺滅（Attract-and-Kill,AK）珠子中的相互作用機制，為開發(fā)高效、環(huán)保的生物殺蟲劑提供科學依據。AK珠子作為一種替代傳統(tǒng)化學殺蟲劑的生物制劑，利用釀酒酵母產生的二氧化碳吸引害蟲，同時綠僵菌在珠子表面形成孢子以感染并殺死害蟲，尤其針對金針蟲等土壤害蟲具有顯著的防控潛力。

研究中，通過微電極技術測量了不同配方珠子內部的氧氣和pH值變化，發(fā)現共包封的AK珠子在2天內就形成了明顯的氧氣梯度，中心區(qū)域出現缺氧狀態(tài)，表明兩種微生物的代謝活動強烈。同時，AK珠子在3天內出現了顯著的酸化現象，pH值下降至3.6，這與二氧化碳的最大生產力和綠僵菌孢子形成率的最大值相吻合，表明酸化可能與微生物的代謝活動密切相關。此外，研究還發(fā)現，降低釀酒酵母的負荷雖然減少了二氧化碳和孢子的總產量，但特定生產力（每1%酵母負荷的生產力）顯著增加，這表明在較低的酵母負荷下，每單位酵母的代謝效率更高。通過調整釀酒酵母的負荷量，可以優(yōu)化珠子的配方，提高其在實際應用中的效率和經濟性。

研究結果表明，綠僵菌和釀酒酵母之間存在復雜的相互作用，既包括有益的協(xié)同作用，也存在資源競爭。這種相互作用對提高AK珠子的殺蟲效果至關重要。未來的研究將進一步深入探索微生物在共包封系統(tǒng)中的相互作用機制，并在此基礎上開發(fā)出更高效、更環(huán)保的生物殺蟲劑配方，以滿足農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。

Unisense微電極系統(tǒng)的應用

Unisense微電極被用于測量共包封的釀酒酵母和綠僵菌在基于海藻酸鈣的吸引和殺滅（珠子內部的氧氣和pH值變化。將微珠固定在定制的3天打印樣品架中。使用數碼顯微鏡目視確定微珠表面，隨后通過手動作顯微縱器（Unisense）插入電極。電極插入的距離略高于預期（20-50μm），然后縮回，以減輕刺穿微珠表面時在點點位置發(fā)生的壓縮，并避免因在電極尖端前形成偽影和擴散屏障而引起的偽氧梯度。26起始深度（-500μm）、最大穿透深度（1200μm）、步長（100μm）、測量次數（3次）、測量時間（1 s）和測量間隔時間（5 s）在專用分析軟件（SensorTrace Profiling，Unisense）中進行管理。該軟件還記錄并可視化了獲得的信號。測量分三次重復進行，并按照制造商的建議，在兩次重復之間用乙醇（96%）、鹽酸（HCl，0.01 m）和水沖洗微電極。珠子內部的pH的使用了玻璃pH微電極，電極尖端直徑為100微米。珠子同樣被固定在樣品架上，參考電極插入一個參考珠子中，兩者通過銅線連接。使用手動雙微操縱器同時插入pH電極和參考電極，測量從珠子表面到內部1600微米的pH值。通過精確測量珠子內部的氧氣和pH值變化，揭示了珠子內部的微環(huán)境動態(tài)。這些數據幫助研究人員理解微生物的代謝活動和相互作用，還為優(yōu)化珠子配方、提高殺蟲效果提供了科學依據。

實驗結果

測量結果顯示，共包封后2天已經出現了陡峭的氧梯度，內部存在低氧區(qū)。包封釀酒酵母或布倫紐分枝桿菌已經將平均pH值分別從5.5降低到4.7和4.6。然而在第3天，共培養(yǎng)導致珠子的時間強酸化至pH值3.6，這遵循最大CO2生產率并與最大分生孢子速率相吻合。降低酵母載量將總CO2生產率降低到一半，分生孢子產量降低93%，而歸一化為1%酵母載量的特定生產率分別增加了8倍和3倍，第3天是一個例外。研究表明，M.brunneum和S.cerevisiae之間存在普遍有益的相互作用，但也表明了對資源的競爭。這些發(fā)現將有助于開發(fā)具有最高效率的創(chuàng)新聯合配方，以節(jié)省施用率和成本。

圖1、通過氧微電極在正面（A）、側面（B）和背面（C）視圖中用于氧氣測量的樣品架的描述。在穿刺部位，發(fā)生了珠子的壓縮，特別是對于不含淀粉的珠子（C），微電極執(zhí)行了進/出運動。

圖2、實驗裝置（A）和用于pH測量的樣品架在帶有pH微電極和外部參比電極（B）的微珠內。測量珠和參比珠通過連接到樣品架的銅線（B，白色箭頭）電接觸。測量過程中的視角（C）。

圖3、綠僵菌（MB）和釀酒酵母（SC）的共包封導致海藻酸鈣/淀粉珠（A）內的氧分布呈陡峭梯度，并顯著降低總氧水平（B）。在25°C的潮濕濾紙上孵育2天后，使用Clark型氧微電極測量整個珠子半徑內不同成分的濕珠內的氧（平均值±標準偏差，n=3）。氧水平歸一化為珠子表面的氧水平。

圖4、綠僵菌（MB）和釀酒酵母（SC）的共包封導致AK珠中pH值的時空降低。在25°C濕濾紙上孵育0-16天后，在整個微珠半徑（0–1600μm）內測量不同成分的濕珠內的pH值。

圖5、二氧化碳（CO 2）生產率（A）和分生孢子形成（B）在每個給定時間點通過減少藻酸鹽/淀粉珠中與綠僵菌共包埋中的釀酒酵母（酵母）載量而顯著降低。珠子要么在室溫下在通風玻璃瓶中的水瓊脂上培養(yǎng)，然后用CO 2計進行測量，要么在23°C的密封培養(yǎng)皿中孵育，并使用細胞計數室測定分生孢子濃度。

結論與展望

吸引殺滅（AK）珠子是生物、微生物殺蟲劑，作為合成土壤殺蟲劑的替代品而開發(fā)。對于線蟲控制，珠子基于藻酸鈣/淀粉共封裝產生二氧化碳（CO 2）的酵母釀酒酵母H205作為吸引成分，昆蟲病原真菌Metarhizium brunneum CB15-III作為殺滅成分。然而共培養(yǎng)過程中珠子內部的物理化學過程仍不清楚。本研究揭示了用微電極測量的AK珠子內氧氣和pH值的時空條件，并描述了釀酒酵母對CO2和分生孢子形成的影響。共包埋的MB和SC存在協(xié)同作用，即使兩種真菌以標準酵母負荷競爭AK珠子中的資源。

Unisense微電極被用于測量共包封的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和綠僵菌（Metarhizium brunneum）在基于藻酸鈣的吸引和殺滅（Attract-and-Kill,AK）珠子內部的氧氣和pH值變化。獲得的數據不僅幫助研究人員理解微生物的代謝活動和相互作用，還為優(yōu)化珠子配方、提高殺蟲效果提供了科學依據。研究結果表明，M.brunneum和S.cerevisiae之間存在普遍有益的相互作用，但也表明了對資源的競爭。這些發(fā)現將有助于開發(fā)具有最大功效的具有成本效益的生物共制劑，從而促進害蟲管理。這些發(fā)現將有助于開發(fā)具有最高效率的創(chuàng)新聯合配方，以節(jié)省施用率和成本。未來需進一步研究微生物之間的相互作用機制，例如在單細胞水平上使用微流控培養(yǎng)系統(tǒng)，以更深入地理解這些復雜的關系。識別珠子內部的物理化學限制或協(xié)同作用對真菌生長和殺蟲效果的影響，以進一步優(yōu)化生物殺蟲劑的配方。