研究簡(jiǎn)介:口臭是牙周病的一種特征性癥狀，由硫酸鹽還原菌產(chǎn)生的揮發(fā)性硫化物(VSCs)引起，如硫化氫(H2S)和甲硫醇。重要的是在體外系統(tǒng)中，可培養(yǎng)的主要牙周機(jī)會(huì)性病原體牙齦卟啉單胞菌(Pg)、核酸棒狀桿菌(Fn)和連翹炭疽桿菌(Tf)通過(guò)氣相色譜法測(cè)量都會(huì)產(chǎn)生H2S。H2S不僅可以由細(xì)菌產(chǎn)生，也可以由宿主的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生。然而，牙周細(xì)菌產(chǎn)生的H2S是否會(huì)影響牙周細(xì)菌周圍溶液中的H2S濃度，這一點(diǎn)尚不明確。H2S與心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)以及炎癥有關(guān)。它通過(guò)特定的酶（如CBS和CSE）自動(dòng)產(chǎn)生，并可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)。牙齦上皮細(xì)胞是牙齦縫隙的第一道防線，對(duì)宿主的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)至關(guān)重要。它們通過(guò)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和抗菌肽來(lái)保護(hù)宿主免受細(xì)菌挑戰(zhàn)。Pg和其他假定的牙周病原體不僅在病變的牙周袋中定植，也會(huì)在健康的牙齦縫隙中定植，但其對(duì)健康牙齦上皮細(xì)胞的影響尚未得到充分研究。研究推測(cè)牙周細(xì)菌產(chǎn)生的H2S可能通過(guò)上調(diào)牙齦上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本研究的目的是監(jiān)測(cè)不同口腔細(xì)菌菌株釋放的H2S濃度，并研究Pg釋放的H2S對(duì)牙齦上皮細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子IL-8的影響。

Unisense硫化氫微電極與氫電極應(yīng)用

細(xì)菌在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，然后調(diào)節(jié)所有菌株的濃度至光密度(OD 590nm)為0.9。然后，將細(xì)菌懸浮液在7000rpm轉(zhuǎn)速下離心15分鐘。上清液立即用針式H2S或H2電極(UnisenseA/S，丹麥)測(cè)量硫化氫(H2S)或氫氣(H2)。每次測(cè)試時(shí)，都要讓傳感器穩(wěn)定下來(lái)，并以5秒鐘的間隔取三個(gè)測(cè)試點(diǎn)。在肉湯中培養(yǎng)的每種細(xì)菌菌株至少要分別進(jìn)行三次H2S和H2的生成檢測(cè)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

IL-8介導(dǎo)的主要生物功能是對(duì)中性粒細(xì)胞(一種清道夫細(xì)胞)的化學(xué)吸引。中性粒細(xì)胞會(huì)遷移到上皮細(xì)胞釋放IL-8的部位，促進(jìn)細(xì)菌的吞噬。一般來(lái)說(shuō)，中性粒細(xì)胞釋放的活性氧(ROS)不僅能殺死細(xì)菌，還能加劇炎癥。H2S介導(dǎo)的上皮細(xì)胞IL-8上調(diào)應(yīng)該會(huì)通過(guò)招募過(guò)多的中性粒細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)該部位的炎癥。體內(nèi)研究表明，內(nèi)源性H2S和外源性H2S都有助于增加中性粒細(xì)胞向胰腺、肺和肝臟炎癥誘導(dǎo)區(qū)的遷移，這支持了我們的假設(shè)，即牙周細(xì)菌釋放的H2S也能促進(jìn)中性粒細(xì)胞向牙周袋的趨化。首次證明了紅色復(fù)合牙周細(xì)菌Pg產(chǎn)生的H2S濃度能夠上調(diào)牙齦和口腔上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)，揭示了可能促進(jìn)牙周疾病炎癥的機(jī)制。

圖1、測(cè)量口腔細(xì)菌釋放的H2S：在厭氧條件下培養(yǎng)屬于不同致病菌群復(fù)合體的14種細(xì)菌，直到它們達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。所有菌株的濃度均調(diào)整至0.9(以O(shè)D 590nm測(cè)量)。使用針式H2S或H2傳感器測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)液中的H2S和H2濃度。

圖2、外源H2S對(duì)OBA9和OKF6細(xì)胞IL-8產(chǎn)量的影響：將匯合培養(yǎng)的牙齦上皮細(xì)胞系(OBA9)或口腔上皮細(xì)胞系(OKF6)暴露于連續(xù)稀釋的H2S供體Na2S中24小時(shí)，無(wú)論是否有PMA(1μmolfL)刺激。用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定OBA9(A)或OKF6(B)產(chǎn)生的培養(yǎng)上清中IL-8的濃度。

圖3、Pg W83釋放的可溶性因子(包括H2S)對(duì)OBA9和OKF6產(chǎn)生IL-8的影響：圖示為transwell檢測(cè)系統(tǒng)(A)。將上皮細(xì)胞OBA9或OKF6培養(yǎng)在下腔中，直至其完全覆蓋組織培養(yǎng)孔表面。隨后，將活體或固定的Pg W83與或不與H2S清除劑一起放入上腔。它們?cè)诤醒装Y刺激物PMA(1μmol/L)的KSF培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)24小時(shí)。用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定OBA9(B,D)或OKF6(C,E)培養(yǎng)上清中IL-8的濃度。

圖4、野生型Pg 33277或Pg KDP137(RGP-KGP-HagA三重缺失突變株)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)液使用針型H2S傳感器檢測(cè)H2S濃度。數(shù)據(jù)為三個(gè)培養(yǎng)物的平均值±SD。(B)OBA9細(xì)胞在下腔培養(yǎng)，Pg KDP137在有或沒(méi)有嗎啉樹脂的PMA(1mmol/L)存在下應(yīng)用于transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)的上腔。共培養(yǎng)48小時(shí)后，用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清液中IL-8的濃度。

結(jié)論與展望

硫化氫(H2S)是一種揮發(fā)性硫化合物，被認(rèn)為是導(dǎo)致炎癥的原因之一，尤其是由胃腸道器官中的細(xì)菌產(chǎn)生的硫化氫。然而，目前還不清楚牙周病原體產(chǎn)生的H2S是否會(huì)影響口腔/牙齦上皮細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。因此本論文研究的目的是比較14株口腔細(xì)菌體外產(chǎn)生H2S的情況；評(píng)估H2S對(duì)宿主口腔/牙齦上皮細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。Unisense微電極系統(tǒng)被用來(lái)精確測(cè)量口腔細(xì)菌在培養(yǎng)基中釋放的硫化氫（H2S）濃度。這種微電極能夠檢測(cè)溶解在溶液中的小氣體分子，包括H2S和氫氣（H2）。評(píng)估了不同細(xì)菌菌株產(chǎn)生的硫化氫量，從而識(shí)別出產(chǎn)生硫化氫最多的菌株，例如牙齦卟啉單胞菌（Pg）。通過(guò)unisense微電極系統(tǒng)測(cè)量硫化氫的濃度，研究人員能夠進(jìn)一步研究硫化氫如何影響宿主細(xì)胞，特別是牙齦和口腔上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-8，從而揭示硫化氫在牙周病炎癥中的作用。牙齦卟啉單胞菌(Pg)在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的H2S最多，這反過(guò)來(lái)又促進(jìn)了牙齦和口腔上皮細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子IL-8。IL-8表達(dá)的上調(diào)在外源性H2S的作用下得以重現(xiàn)。此外不產(chǎn)生主要可溶性毒力因子(即齦肽酶)的Pg突變菌株仍會(huì)產(chǎn)生H2S，并促進(jìn)上皮細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生，而H2S清除試劑則會(huì)抑制這種作用。這些結(jié)果表明，Pg產(chǎn)生的H2S濃度能夠上調(diào)牙齦和口腔上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)，揭示了可能促進(jìn)牙周病炎癥的機(jī)制。Unisense微電極系統(tǒng)癌本研中它為研究人員提供了一種精確、可靠的方法來(lái)測(cè)量和分析口腔細(xì)菌產(chǎn)生的硫化氫，這對(duì)于理解硫化氫在牙周病中的作用機(jī)制至關(guān)重要。